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 【背景介紹】

糖尿病患者傷口愈合不良導致世界范圍內高發病率和高死亡率。受傷后恢復皮膚的完整性，體內穩態以及保護功能對人類生存至關重要。除細菌感染外，敵對的高血糖和氧化微環境進一步阻礙了糖尿病皮膚傷口的恢復。在糖尿病條件下，包括中性粒(白)細胞在內的免疫細胞會產生更多的活性氧（ROS），導致糖尿病器官受損，形成瘢痕時間延長或傷口無法愈合。此外，高血糖癥可引起血管收縮并抑制血管新生，這是通過阻斷氧氣供應而阻礙了愈合過程。因此，迫切需要開發一種有效的策略以消除ROS和連續供應O2來有效調節血糖。一種新型的二氧化錳（MnO2）納米片（即:納米酶）已被證明能催化最豐富的內源性ROS（H2O2）分解成O2，這代表了緩解氧化壓力和缺氧的有希望的候選物。胰島素是治療1型和2型晚期糖尿病患者以維持正常血糖的必需激素。因此，將胰島素遞送和MnO2納米酶整合到生產中，將有利于促進皮膚傷口的愈合。

【科研摘要】

糖尿病傷口的愈合仍然是一項嚴峻的挑戰,因為其易受多重耐藥性（MDR）細菌感染以及高血糖和氧化性傷口微環境的影響。近日，西安工業大學長江學者張秋禹教授團隊開發了可注射自愈粘附性水凝膠（FEMI）以同時克服這些障礙（圖1）。

圖1. FEMI水凝膠用于MDR細菌感染的糖尿病傷口愈合示意圖。

FEMI水凝膠是通過ε-聚賴氨酸（EPL）涂覆的MnO2納米片（EM）和負載胰島素的自組裝Pluronic F127醛（FCHO）膠束之間基于席夫堿（Schiff-based）反應制備的。通過EPL和MnO2納米片之類的“納米刀”的協同組合，FEMI水凝膠對MDR細菌表現出了極好的抗菌能力。MnO2納米酶通過將內生的H2O2分解為O2，從而重塑了氧化傷口微環境。同時，pH/氧化還原雙響應FEMI水凝膠實現了胰島素的持續時空控制釋放，以調節血糖。作者研發的FEMI水凝膠證明了體內感染了MDR細菌的糖尿病傷口愈合加速，并且代表了一種用于治愈由糖尿病引起的廣泛組織損傷的通用策略。該研究以題為“Nanoenzyme-Reinforced Injectable Hydrogel for Healing Diabetic Wounds Infected with Multi-Drug Resistant Bacteria”的論文發表在6月《Nano Letters》上。

【圖文探討】

1. pH和氧化還原響應的FEM水凝膠的合成與表征

從水鈉錳礦型的MnO2前體剝離二維各向異性MnO2納米片。通過透射電子顯微鏡（TEM）和原子力顯微鏡（AFM）表征了地形特征。詳細地，測得MnO2納米片的尺寸為約330.86 nm，而厚度為約6.40 nm（圖2a）。EPL通過簡便的靜電組件涂覆在MnO2納米片的表面上，這可以通過zeta電位測量來確定（圖2b）。芳香環在7.86和7.06 ppm處出現新的共振信號和醛基（-CHO）為9.90 ppm，表明形成了FCHO（圖2c）。此外，掃描電子顯微鏡（SEM）和TEM圖像顯示了平均直徑為1.15μm的自組裝FCHO膠束。還進行了傅立葉變換紅外（FTIR）（圖2d）。在1687 cm-1處沒有醛帶，在1662 cm-1處沒有新峰，表明FEMI水凝膠是通過EM和FCHO之間Schiff-based的反應成功形成的。此外，通過SEM分析進行了FEMI水凝膠的形態學特征（圖2e）。進一步進行了X射線衍射（XRD）光譜分析，確定了水鈉錳礦型MnO2納米片的典型峰，表明MnO2納米片已成功整合到FEMI水凝膠中。FEMI的元素（例如C，O和Mn）均在能量色散光譜儀（EDS）映射圖中進行了說明（圖2f，g）。FEM水凝膠由于存在FCHO而表現出獨特的熱敏性，臨界的溶膠-凝膠轉變溫度從15.5℃降低到11℃，并且通過增加EM從0.05％到0.2％（FEM-1 0.05%,FEM-2 0.10%,FEM-3 0.15%,FEM-4 0.20%），機械性能急劇提高（圖2h）。經過三次循環應變后，儲能模量(G')和損耗模量(G'')在低應變（1％）下快速恢復，顯示出FEM水凝膠具有出色的自愈能力（圖2i）。此外，FEM水凝膠對豬皮膚的定量粘合強度可以達到1.58 kPa，遠高于純皮膚(636.6 Pa)，進一步證明了其高粘合性。特別是，FEM-4水凝膠的粘度從368.5急劇下降至約7.7 Pa·s，剪切速率從0.1變為100 1/s。

圖2.（a）MnO2納米片TEM圖像。（b）在pH 7.4下測得的EPL，MnO2納米片，EM納米片的Zeta電位。（c）FCHO的1H NMR光譜。（d）分別為F127，F127-SO3，FCHO，MnO2納米片（NS），EPL，EM和FEMI的FTIR光譜。（e）獨特3D多孔結構的FEMI水凝膠SEM圖像。（f）FEMI水凝膠放大SEM圖像和EDS元素圖。（g）EDS驗證FEMI水凝膠中Mn離子含量。（h）FEM-4水凝膠的G’和G’’隨溫度從10到38°C。插圖：FEM-4水凝膠的溶膠-凝膠轉變照片。（i）FEM-4水凝膠的機械性能通過在37°C下在1％和1000％之間的三倍剪切應變循環期間測試G'和G'來評估。（j）通過剪脫試驗評價FEM水凝膠對皮膚組織的粘合強度。（k）剪切速率為0.1至100 1/s的FEM水凝膠的粘度。插圖：FEM水凝膠可注射性的照片。

2. 減輕氧化應激來增強細胞的存活增殖。

作者將MnO2納米片作為納米酶摻入FEM水凝膠中，以發揮ROS清除和O2補充劑的雙重作用（圖3a）。觀察到清晰的MnO2納米片的濃度依賴性H2O2分解和O2產生（圖3b-d）。與H2O2對照組相比，與FEM-4水凝膠共同孵育的成纖維細胞顯示出顯著更低的綠色熒光（4.34倍），這表明FEM水凝膠可以有效減輕細胞內的氧化應激（圖3e，g）。然后，還通過O2水平指示劑[Ru(dpp)3Cl2]評估了細胞內O2的升高，證實了明顯的MnO納米酶含量依賴性O2生成，因為[Ru(dpp)3Cl2]的熒光被顯著淬滅（圖3f，h）。研究了FEMI水凝膠的體外胰島素釋放行為（圖3i）。 最后，還進行了成纖維細胞的體外增殖（圖3j，k）。與FEM水凝膠一起培養的成纖維細胞在5天的培養期內顯示出持續增殖，與對照組相比沒有顯著差異。

圖3.（a）減輕FEM水凝膠中MnO2納米片催化氧化應激并生成O2的示意圖。（b）通過測量H2O2指示劑溶液的UV-Vis吸收光譜評估MnO2納米片對H2O2的劑量依賴性消除。（c）應用不同MnO2納米片含量的水凝膠后，對溶液中殘留的H2O2進行定量分析。（d）用商業氧氣計記錄了大量氧氣的產生。（e）在不同處理后通過ROS探針（DCFH-DA）監測L929細胞中氧化應激的減輕。（f）通過O2探針驗證了細胞內O2生成測定。（g-h）分別通過計數L929細胞的熒光強度來分析細胞內ROS消耗和O2產生的定量研究。（i）pH和氧化還原雙重反應性胰島素釋放動力學。（j-k）通過活/死染色進行成纖維細胞的體外增殖。

3. FEM水凝膠的抗菌性能和止血能力。

作者在體外對FEM水凝膠的抗菌性能進行了綜合評估。這里使用金黃色葡萄球菌，MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，革蘭氏陽性）和大腸桿菌（革蘭氏陰性）作為模型細菌（圖4a，b）。期望地，與PBS和抗生素氨芐西林相比，FEM水凝膠對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和MRSA表現出優異的抗菌能力。當它們附著在MnO2納米片表面時，微生物的形態會受到影響，并且在與EM膜和FEM水凝膠孵育后變得更加粗糙和受損（圖4c）。使用小鼠出血性肝模型評估了FEM水凝膠的止血能力（圖4d）, 因為出色的抗菌能力和出色的生物相容性，作者決定將FEM-4水凝膠用于隨后的體內止血和傷口愈合研究。盡管FCHO水凝膠和商品merocel（止血海綿）組的出血量在一定程度上有所降低（分別為3.5倍和4.2倍），但與空白對照組相比， FEM治療組的失血量明顯減少（21.2倍）（圖 4e，f）。

圖4.（a-c）具有不同EM含量的FEM水凝膠的抗菌活性分析。（d）說明在糖尿病小鼠的肝出血模型中FEM水凝膠的止血能力的示意圖。（e）經對照（未治療），merocele，FCHO和FEM水凝膠治療的受損肝臟的總失血量。（f）在0、5、15、30、60 s的某些時間經過上述處理的肝臟的代表性照片。

4.FEMI水凝膠通過構建微環境促進糖尿病傷口愈合。

作者使用MRSA感染的糖尿病創傷模型進一步檢查了FEMI水凝膠的細菌抑制和傷口愈合能力（圖5a）同時，在持續的傷口愈合實驗中，用FEM和FEMI處理的小鼠的傷口顯示出明顯加速的傷口閉合。更具體地說，FEM組和FEMI組在第7天分別導致傷口閉合71.9％和78.2％，明顯高于PBS對照組（39.9％），AM組（44.1％）和FCHO組 （58.1％）。 值得注意的是，在第14天，裝有FEMI水凝膠的傷口愈合最好（剩余11.70％），基本上被新形成的皮膚覆蓋（圖5b-d）。作者在實驗期間進一步監測了血糖和胰島素水平。 血漿胰島素水平從21μU/ml增加到259μU/ml，與血糖水平升高有關，然后在第5天逐漸降低至38μU/ml（圖5e）。

圖5.（a）示意圖論述了FEMI水凝膠的抗菌行為和加速傷口閉合性能的操作過程時間軸。（b）用對照，抗生素氨芐青霉素，FCHO，FEM和FEMI水凝膠治療小鼠傷口愈合過程的圖像。（c）每種治療在14天內傷口床閉合的痕跡。（d）五組在不同時間點的體內傷口閉合率。（e）五個糖尿病小鼠組在不同時間點的血糖變化。（f）在不同處理之后，通過ROS探針（二氫乙啶，DHE）監測傷口區域中的ROS水平。（g）氧化DHE熒光強度的直方圖顯示FEM和FEMI水凝膠組中有效消耗了ROS。（h）在第3、7和14天五種不同治療方法的傷口再生的組織形態學評估。（i）在第7天，不同組的表皮厚度。（j）在第7和14天的再生血管。（k）在第14天，不同組的毛囊。

接著，作者進行了全面的研究，以揭示潛在的機制并評估傷口的愈合進度。 首先，作為糖尿病中典型的炎癥因子，體內的細胞內ROS水平通過二氫乙啶（DHE）染色指示（圖5f，g）。 正如預期的那樣，由于對FEM水凝膠進行敷料，我們觀察到紅色熒光顯著減少，表明其出色的抗氧化性能。 更令人驚訝的是，胰島素包封組（FEMI）顯示出甚至更低的ROS產生，這可能歸因于葡萄糖水平的降低。 還評估了阻礙組織恢復的典型炎性細胞因子白介素-6（IL-6）。 與其他對照組相比，FEMI組表現出顯著的下調，表明水凝膠緩解了炎癥反應。傷口再上皮形成和肉芽組織形成已被鑒定為評估傷口愈合過程的典型指標。 隨著修復過程的進展，在第7天，FEMI治療組形成了多層，完全連接且較厚的（182.2 um）上皮結構，非常類似于完整皮膚的健康表皮（圖5h，i）。作者推測葡萄糖水平降低可以促進血管形成。H＆E染色圖像進一步證實實驗組中形成了更多的血管，這提供了促進傷口愈合的刺激因素（圖5j）。

【觀點總結】

總之，作者設計并驗證了一種可有效促進MDR細菌感染的糖尿病傷口愈合的可注射，粘合，自愈，抗氧化和抗菌的FEMI水凝膠。通過引入2D EM納米填料與聚合物基質相互作用，制備了具有快速凝膠行為和穩定流變性能的水凝膠。通過將帶正電的EPL和“納米刀”（如MnO2納米片）協同結合， FEMI水凝膠在體外和體內對MDR細菌均顯示出非凡的抗菌能力。此外，FEMI水凝膠在小鼠肝損傷模型中也表現出出色的止血作用。在糖尿病傷口獨特的酸性和氧化性微環境下，證明了FEMI水凝膠通過將內源性H2O2轉化為O2并同時釋放胰島素來調節血糖水平，從而有效緩解了氧化應激。

FEMI水凝膠將MDR細菌的消滅，高血糖癥的緩解，氧化應激的改善，持續的O2生成整合到一個平臺中，從而協同地減少了炎癥反應，刺激了血管生成，加速了細胞增殖，促進了肉芽組織的形成和ECM沉積，并顯示了加速糖尿病發展的巨大潛力體內皮膚重建。據悉，這是首次通過全面構建有益的皮膚微環境構建多功能水凝膠以促進MDR感染的糖尿病傷口愈合的研究。總的來說， FEMI水凝膠表明了一種廣泛的策略，可以再生受到細菌入侵和高氧化性疾病微環境影響的糖尿病中廣泛的受損組織。

【通訊簡介】

張秋禹，“長江學者”特聘教授，博士生導師，西北工業大學應用化學研究所所長，中國化學會會員，陜西省化學會理事，中國材料研究學會高分子材料與工程分會委員，陜西省環境學會理事，中國顆粒學會理事等。《高分子材料》、《化學工程》、《粘接》等期刊編委。她目前主要研究領域包括1.運用點擊化學控制高性能聚合物的制備，微/納米響應性多孔有/無機雜化納米及功能復合材料，發表了超過200篇SCI在國際期刊上。培養碩博士超過15人。