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 【摘要】

生物粘合劑可減少手術時間和手術并發(fā)癥。 然而，在有血液的情況下，粘附強度通常會受到影響。受蛇毒凝血活性的啟發(fā)，加拿大曼尼托巴大學Malcolm Xing（譯：馬爾科姆·邢）教授，與第三軍醫(yī)大學Rixing Zhan博士/羅高興教授團隊團隊報告了一種可見光誘導的抗血止血粘合劑 (HAD)，其中含有甲基丙烯酰明膠和爬蟲酶，這是一種從 Bothrops atrox 中提取的血凝酶 (HC)。

HAD 導致血小板的活化和聚集，并有效地將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而實現(xiàn)快速止血和封閉組織。HAD 的凝血時間約為 45 秒，而沒有 HAD 的凝血時間為 5 至 6 分鐘。HAD 立即在肝臟切口（~45 秒）和切鼠尾（~34 秒）上實現(xiàn)止血，并分別減少了 79% 和 78% 的失血量。HAD 在密封嚴重受損的肝臟和腹主動脈方面也很有效。有通過結合止血和粘合劑來橋接受傷組織的巨大潛力。相關論文以題為Snake extract–laden hemostatic bioadhesive gel cross-linked by visible light發(fā)表在《Science Advances》上。

【主圖導讀】

HAD的制備和表征

可見光交聯(lián)粘合劑是由光敏劑曙紅 Y 激活的 GelMA 上的 MA 側基的光化學反應形成的。反應機理如圖 1A 所示。當暴露在可見光下時，HAD 的交聯(lián)可以在曙紅 Y、TEA 和 VC 的幫助下通過自由基聚合實現(xiàn)。圖 1B 顯示了響應 60 秒可見光曝光的 HAD 凝膠形成的數(shù)字圖像。圖 1C 顯示了所有組分的紫外-可見 (UV-vis) 吸收光譜。隨著反應的進行，紅色曙紅Y變得幾乎無色，在450～550nm處吸收能力下降。如圖 1D 所示，隨著光照時間的增加，從 430 到 550 nm 的吸收逐漸下降。掃描電子顯微鏡（SEM）（圖 1，E 和 F）表明 GelMA 和 HAD 的微觀結構清晰，壁光滑，多孔，平均孔徑約為 50 μm，這表明 HC 的存在不影響原始的 GelMA 結構。

圖 1 HAD 的制備和表征。(A) 可見光誘導的光聚合系統(tǒng)的示意圖。(B) 在可見光照射之前（頂部）、期間（中間）和之后（底部）的 HAD 膠凝轉(zhuǎn)變的數(shù)碼照片。(C) TEA、VC、HC、GelMA、曙紅 Y、GelMA 預聚物和 HAD 預聚物的 UV-vis 吸收光譜。(D) 照射 0、20、40 和 60 秒后 HAD 的紫外可見吸收光譜。(E 和 F) 分別為 GelMA 和 HAD 的 SEM 圖像。

HAD的機械性能

在HAD上進行流變測試以監(jiān)測膠凝過程。從動態(tài)時間掃描（圖 2A）來看，在曝光前儲能模量 G' 低于損耗模量 G"，但隨著光照時間的增加，G' 值在 30 秒時超過 G"，證實了不可逆凝膠化 (33)。如圖 2B 所示，當應變大于 274% 時，G" 高于 G'，表明凝膠坍塌。振蕩頻率測試表明粘合劑在 0.1 到100 rad/s條件下是穩(wěn)定的（圖 2C）。

圖3 HAD的體外止血性能。(A) 通過血漿凝固動力學選擇要摻入 GelMA 的 HC 量。(B) 血漿凝固動力學曲線線性區(qū)域的斜率（凝固率）。(C) 包含在 HAD 中的 HC 的釋放。(D) 作為控制時間函數(shù)的凝塊形成、HC、GelMA、HAD 和纖維蛋白膠。(E) 定量凝血時間。(F 到 H) 全血與 GelMA 接觸的 SEM 圖像分別為 1、2 和 3 分鐘。（I 到 K）全血與 HAD 接觸的 SEM 圖像分別為 1、2 和 3 分鐘。

圖4 HAD在大鼠截尾模型中的止血性能。(A) 大鼠尾出血止血模型建立示意圖。(B) 鼠尾模型中的止血測試過程。(C) 不同治療的定性出血圖像。(D 和 E) 分別是失血和止血時間。

圖 5 不同處理的皮膚傷口閉合。(A) 皮膚切口示意圖。(B) 第 0、3、5 和 20 天（D0、D3、D5 和 D20）的切口照片。(C) 第 5 天和第 20 天傷口的 H&E 染色。

圖6 HAD在肝損傷中的止血特性。(A) 建立大鼠肝臟止血和止血的示意圖。(B) 肝損傷檢測過程。(C) 用紗布治療肝損傷。(D) 肝臟的時程出血圖像。(E 和 F) 止血時間和失血量。(G) 第 5 天傷口的 H&E 染色。

圖 7 對嚴重損傷肝臟的止血作用。(A) 止血過程的示意圖。(B) 在嚴重肝傷口模型中使用 HAD 的止血測試過程。(C) GelMA 在嚴重肝傷口模型中的止血測試過程。(D) 作為對照組的未經(jīng)處理的傷口。

圖8 HAD對大鼠腹主動脈損傷模型的止血作用。(A) 大鼠腹主動脈損傷模型建立及密封示意圖。(B) HAD大鼠腹主動脈損傷模型的止血和密封試驗。(C) GelMA 大鼠腹主動脈損傷模型的止血和密封試驗。(D) 由 HAD 密封的腹主動脈的外表面圖像。(E) 由 HAD 密封的腹主動脈的內(nèi)表面圖像。(F 和 G) HAD 密封腹主動脈受到大的彎曲和扭曲。(H) HAD 和腹主動脈之間界面的 SEM。

圖9 體內(nèi)止血表面和界面的SEM研究。(A-C) SEM 觀察區(qū)域示意圖。SEM觀察區(qū)域I如(A1)和(A2)所示；SEM觀察區(qū)II如(B1)和(B2)所示；SEM觀察區(qū)域III如(C)所示。（A1 和 A3）GelMA 組止血后外部血凝塊的 SEM。（A2 和 A4）HAD 組止血后外部血凝塊的 SEM。(B1) 出血肝臟和 GelMA 之間內(nèi)部界面的 SEM (白色箭頭)。(B2) 出血肝臟和 HAD 之間內(nèi)部界面的 SEM (白色箭頭)。(C1) 內(nèi)部傷口的 SEM。

圖 10 經(jīng) HAD 處理的大鼠肝臟中血凝塊的 SEM。(A)SEM 觀察區(qū)域的圖示。(B)所示的SEM觀察區(qū)域I；(C)和(D)所示的SEM觀察區(qū)II；(E)～(J)所示的SEM觀察區(qū)域III。(B) 纖維蛋白和紅細胞相互作用的 SEM。(C 和 D) 內(nèi)部凝塊的 SEM 圖像。(E 到 G) 30 秒和 1 分鐘和 2 分鐘時肝臟出血的 RBC SEM。(H) 血小板拉動和彎曲纖維蛋白纖維以產(chǎn)生收縮應力并導致凝塊收縮。(I)血小板變形形成致密結構。(J) 內(nèi)部收縮的血小板形成了一個緊密堆積的、鑲嵌的壓縮多面體陣列，形成了一個對止血很重要的致密屏障。(K) 凝塊體積隨時間收縮的凝塊收縮過程。

【總結】

該團隊結果強烈表明，HAD 可以是一種有效的止血組織粘合劑/密封劑，尤其是在不可壓縮的出血組織中，例如導致相當大死亡率的彌漫性創(chuàng)傷性大出血和動脈出血。從組織穿透的角度來看，可見光誘導的交聯(lián)系統(tǒng)可以達到 2.5 mm 的厚度。這有利于治療可觸及的厚傷口，因為 HC 的受控釋放甚至可以進一步擴散并誘導止血，這已在嚴重受傷的肝臟模型中得到證實。此外，可見光可交聯(lián)的 HAD 系統(tǒng)也可能是直接應用于具有廣泛出血的更深組織損傷模型的有價值的候選者，應在未來的研究中予以考慮。HAD在不同組織器官中的可控降解率也值得未來研究。

參考文獻：

Science Advances 14 Jul 2021:

Vol. 7, no. 29, eabf9635

DOI: 10.1126/sciadv.abf9635

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的厚度。這有利于治療可觸及的厚傷口，因為 HC 的受控釋放甚至可以進一步擴散并誘導止血，這已在嚴重受傷的肝臟模型中得到證實。此外，可見光可交聯(lián)的 HAD 系統(tǒng)也可能是直接應用于具有廣泛出血的更深組織損傷模型的有價值的候選者，應在未來的研究中予以考慮。HAD在不同組織器官中的可控降解率也值得未來研究。